酶联免疫吸附测定（ELISA）实验详解

发布时间：2026-01-16 18:03:03

酶联免疫吸附测定（ELISA）实验详解

一、 实验原理

酶联免疫吸附测定是一种基于抗原-抗体特异性结合和酶催化显色反应，用于检测样品中微量目标物质（抗原或抗体）的经典免疫学技术。其核心原理可概括为：

· 免疫识别：将已知的抗原或抗体固定在固相载体（通常是聚苯乙烯微孔板）表面。

· 特异性结合：待测样本中的目标分子与固相上的捕获分子发生特异性结合。

· 酶标记与放大：通过酶标记的抗体与目标分子结合，形成“抗原-抗体-酶标抗体”复合物。

· 信号产生与检测：加入酶的无色底物，在酶催化下生成有色产物。通过测定吸光度值，其强度与样本中目标分子的浓度成正比，从而实现定量或定性分析。

二、 主要实验类型

直接ELISA

· 流程：将抗原直接包被于板子 → 加入酶标一抗 → 加入底物显色。

· 特点：步骤简单，但信号可能较弱，且每种待测物都需要特定的酶标抗体。

间接ELISA

· 流程：将抗原包被于板子 → 加入一抗（样本或特异性抗体） → 加入酶标二抗（抗一抗的抗体） → 加入底物显色。

· 特点：最常用。通过酶标二抗实现信号放大，灵活性强，灵敏度高于直接法。

夹心ELISA

· 流程：将捕获抗体包被于板子 → 加入样本（含待测抗原） → 加入检测抗体（与抗原另一表位结合） → 加入酶标二抗（抗检测抗体的抗体）→ 加入底物显色。

· 特点：灵敏度最高，特异性最强。适用于检测复杂样本中的微量抗原。要求抗原至少有两个不同的抗原表位。

竞争ELISA

· 流程：将已知抗原包被于板子 → 同时加入样本（含待测抗原）和定量的酶标抗体 → 两者竞争结合固相抗原 → 加入底物显色。

· 特点：颜色深度与样本中待测抗原浓度成反比。适用于检测小分子抗原（半抗原）。

三、 标准实验步骤（以间接ELISA检测抗体为例）

前期准备

· 试剂：包被缓冲液、封闭液、洗涤液（PBST）、样本稀释液、一抗、酶标二抗、底物溶液、终止液。

· 仪器：酶标仪、微孔板、移液器、恒温箱。

操作流程

· 包被：用包被缓冲液稀释已知抗原，加入微孔板，4℃过夜或37℃孵育2小时。

· 洗涤：弃去孔内液体，用PBST洗涤3次，拍干。

· 封闭：每孔加入封闭液（如1-5% BSA或脱脂奶粉），37℃孵育1-2小时，以覆盖未结合位点，减少非特异性吸附。

· 洗涤：同步骤2。

· 加一抗：加入用稀释液系列稀释的待测样本（或阳性/阴性对照），37℃孵育1-2小时。

· 洗涤：同步骤2。

· 加酶标二抗：加入稀释好的酶标二抗，37℃避光孵育1小时。

· 洗涤：同步骤2，此步骤需彻底，避免背景过高。

· 加底物显色：加入新鲜配制的底物溶液（如TMB），37℃避光孵育10-30分钟，可见孔内液体变蓝。

· 终止与读数：加入终止液（如2M H₂SO₄）终止反应，液体由蓝变黄。在酶标仪上于特定波长（如TMB为450nm）读取各孔吸光度值。

四、 数据处理与结果分析

· 计算：通常读取复孔的平均值，并减去空白孔的吸光度值。

标准曲线绘制（定量分析）

· 使用已知浓度的标准品进行系列稀释，与样本同步检测。

· 以标准品浓度为横坐标（对数坐标），吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线（通常为S型或线性）。

· 根据样本的吸光度值，在标准曲线上插值计算出其浓度。

临界值判定（定性分析）

· 通常设定为阴性对照平均值的2.1倍或3倍标准差以上为阳性。

五、 关键影响因素与优化

· 包被：抗原/抗体浓度、包被缓冲液pH（通常9.6碳酸盐缓冲液）、包被时间和温度。

· 封闭：封闭剂的选择（BSA、酪蛋白、明胶、血清等）和浓度至关重要。

· 孵育：温度、时间和振荡条件影响结合效率。

· 洗涤：洗涤不彻底会导致高背景，过度洗涤可能洗脱结合物。

· 抗体与酶：抗体的特异性、亲和力及酶（HRP或AP）的活性是关键。

· 样本：样本类型、基质效应、稀释比例需优化。

六、 应用领域

· 医学诊断：抗体/抗原检测、自身免疫病抗体检测、激素水平测定、肿瘤标志物筛查。

· 生物研究：蛋白质表达定量、蛋白质相互作用研究、信号通路磷酸化检测。

· 食品安全：检测食品中的过敏原、毒素、农药残留、病原微生物。

· 药物研发：药代动力学研究、抗体药物效价测定。

· 农业科学：植物病毒检测、转基因成分分析。

七、 优缺点

优点

· 灵敏度高（可达pg/mL级别）。

· 特异性强。

· 高通量，可同时处理大量样本。

· 操作相对简便，成本较低。

· 结果可定量，重复性好。

缺点

· 只能检测可溶性抗原/抗体。

· 开发过程需要高质量的配对抗体（夹心法）。

· 存在“钩状效应”（高浓度样本假阴性）风险。

· 操作步骤多，易受人为因素影响。

总结

ELISA作为一种成熟、强大的生物分析工具，自1970年代发明以来，已成为生命科学和医学领域不可或缺的基石技术。其成功的关键在于严谨的实验设计、细致的流程操作和严格的质量控制。随着技术进步，出现了更快速、更灵敏的变体（如化学发光ELISA、快速试纸条等），但传统ELISA的核心原理和操作逻辑依然是理解和应用所有免疫检测方法的基石。

                                                                                                                                                                     网络转载，如有侵权联系删除